Iranian Journal of Horticultural Science and Technology

fa بهینه‌سازی استخراج اسید نوکلئیک از سیکلامن ایرانی (Cyclamen coum Miller) Optimization of Nucleic Acid Extraction from Cyclamen coum Miller بیوتکنولوژی و کشت بافت Biotechnology and Tissue culture پژوهشي Research <div style="text-align: justify;">سیکلامن هم به عنوان گیاه زینتی و هم دارویی شناخته شده است. عصاره این گیاه، فعالیت زیستی قوی و محتوای پلی فنولی، تانن و پروتئین بالا دارد. به دلیل وجود این ترکیبات بازدارنده، استخراج اسیدهای نوکلئیک از گیاه دشوار است. بیشتر آزمون‌‌های زیستی با استخراج DNA و RNA آغاز می‌‌شود. بنابراین، انتخاب یک روش استخراج مناسب، قابل اعتماد و تکرارپذیر، اهمیت زیادی دارد. در این آزمایش، بهینه‌سازی استخراج اسیدهای نوکلئیک از گیاه سیکلامن ایرانی (Cyclamen coum Miller) و امکان بیان ژن‌های خانه‌دار مناسب در این گونه،  ارزیابی شد. پس از جمع‌‌آوری نمونه‌‌های گیاهی از سه اندام برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل، برای استخراج DNA روش‌‌های تغییریافته CTAB و SDS و برای استخراج RNA روش‌های Trizol تغییریافته، CTAB-LiCl و RNX-Plus، استفاده  شد. کیفیت و کمیت DNA و RNA استخراج شده از راه الکتروفورز، اسپکتروفتومتری و PCR بررسی شد. <a name="_Hlk133761909">برای تایید کیفیت </a>DNA استخراج شده وجود قطعات ژن‌‌های 18S ریبوزومی، اکتین (ACT)، توبولین (TUB) و فاکتور طویل‌سازی (EF-1a) به عنوان ژن خانه‌دار با کمک PCR بررسی  شد. بر اساس نتایج به‌دست آمده، کمترین غلظت DNA‌‌ در روش CTAB تغییریافته مشاهده شد. غلظت و کیفیت DNA نمونه‌های برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل در روش SDS تغییریافته بهتر از روش CTAB بود. مقایسه سه روش Trizol تغییریافته، CTAB-LiCl و RNX-Plus در استخراج RNA، نشان داد که روش Trizol تغییریافته از لحاظ وضوح نوارها و غلظت RNA استخراج شده بهتر از دیگر روش‌ها بود. با استفاده از این پروتکل، نسبت جذب A260/280 نانومتر از 01/2 تا 10/2 متغیر بود که نشان دهنده کیفیت بالای RNA جدا شده بدون آلودگی فنولی یا پروتئینی است. علاوه بر این، نسبت A260/A230 نانومتر بین 99/1 و 15/2 بود که نشان می‌دهد RNA استخراج شده بدون پلی ساکارید است. ساخت cDNA از RNA استخراج شده از سه بافت سیکلامن ایرانی تنها در دو روش Trizol و RNX-Plus با موفقیت انجام شد. برای بررسی کیفیت نمونه‌های RNA، امکان بیان ژن‌های خانه‌دار با استفاده از RT-PCR ارزیابی شد. نتایج RT-PCR نشان داد که در بین ژن‌های خانه‌دار، TUB و 18S در همه نمونه‌های برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل سیکلامن ایرانی از وضوح باند بیشتر و کیفیت بالاتری برخوردار بودند.  </div> <div style="text-align: justify;"></div> <div style="text-align: justify;">Most molecular genetic tests begin by extracting DNA and RNA. To achieve this, obtaining a suitable, reliable, and repeatable extraction method is of great importance. In this regard, optimization of the extraction of nucleic acids from the Iranian cyclamen plant (Cyclamen coum Miller) and the introduction and expression of housekeeping genes was performed. After collecting plant samples from the three organs of leaf, petal and hypocotyl, modified CTAB and SDS methods were used for DNA isolation and modified Trizol, CTAB-LiCl and RNX-Plus methods were used for RNA isolation. The quality of isolated DNA and RNA was checked by electrophoresis and their concentration was measured with nanodrop. The presence of 18S ribosomal, actin (ACT), tubulin (TUB) and elongation factor (EF-1a) gene fragments was investigated using polymerase chain reaction (PCR). Based on the results, the lowest DNA concentration was related to the CTAB method. The DNA concentration and quality of Iranian cyclamen leaf, petal and hypocotyl samples were higher in the modified SDS method than in the CTAB method. The isolation of DNA using the modified SDS method not only had a high purity but also had relatively high performance. According to quality analysis of the RNA isolated from leaf, petal, and hypocotyl samples using Trizol, CTAB-LiCl, and RNX-Plus protocols, all three strategies may be used to isolate RNA from Iranian cyclamen tissues. However, the Trizol method is superior to other methods in terms of high band resolution and RNA concentration. The production of cDNA from RNA isolated from three Iranian cyclamen tissues was successfully performed only by Trizol and RNX-Plus methods. Based on the results, cDNA made from RNA isolated by Trizol method had better quality. To check the efficiency of RNA samples in RT-PCR reaction and the expression of housekeeping genes, RT-PCR test was performed. Based on the results, the presence of the bands related to the housekeeping genes fragment in the electrophoresis stage confirmed the good quality of the produced cDNA and also indicated the high quality of the isolated RNA from the Trizol and RNX-Plus methods. RT-PCR results showed that the expression of actin, EF-1a, 18S and tubulin gene was positive in most Iranian cyclamen organs. Among housekeeping genes, tubulin and 18S genes, had higher band resolution and higher quality in all samples and tissues.</div> استخراج RNA, Trizol, Cyclamen coum, استخراج DNA, ژن خانه‌دار Nucleic acid, RNA extraction, Phenol-Chloroform, RNX, Tarizol, CTAB 503 524 http://journal-irshs.ir/browse.php?a_code=A-10-747-1&slc_lang=fa&sid=1 Mohammad Sadegh Tamkin محمد صادق تمکین mst.sunboy.1366@gmail.com 100319475328460010103 100319475328460010103 No گروه علوم باغبانی و زراعی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران Marzieh Ghanbari Jahromi مرضیه قنبری جهرمی ghanbari@srbiau.ac.ir 100319475328460010104 100319475328460010104 Yes گروه علوم باغبانی و زراعی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران Amir Mousavi امیر موسوی m-amir@nigeb.ac.ir 100319475328460010105 100319475328460010105 No پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران