گروه علوم باغبانی و زراعی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران
چکیده: (1970 مشاهده)
سیکلامن هم به عنوان گیاه زینتی و هم دارویی شناخته شده است. عصاره این گیاه، فعالیت زیستی قوی و محتوای پلی فنولی، تانن و پروتئین بالا دارد. به دلیل وجود این ترکیبات بازدارنده، استخراج اسیدهای نوکلئیک از گیاه دشوار است. بیشتر آزمونهای زیستی با استخراج DNA و RNA آغاز میشود. بنابراین، انتخاب یک روش استخراج مناسب، قابل اعتماد و تکرارپذیر، اهمیت زیادی دارد. در این آزمایش، بهینهسازی استخراج اسیدهای نوکلئیک از گیاه سیکلامن ایرانی (CyclamencoumMiller) و امکان بیان ژنهای خانهدار مناسب در این گونه، ارزیابی شد. پس از جمعآوری نمونههای گیاهی از سه اندام برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل، برای استخراج DNA روشهای تغییریافته CTAB وSDSو برای استخراج RNA روشهای Trizol تغییریافته، CTAB-LiCl و RNX-Plus، استفاده شد. کیفیت و کمیت DNA و RNA استخراج شده از راه الکتروفورز، اسپکتروفتومتری و PCR بررسی شد. برای تایید کیفیت DNA استخراج شده وجود قطعات ژنهای 18Sریبوزومی، اکتین (ACT)، توبولین (TUB) و فاکتور طویلسازی (EF-1a) به عنوان ژن خانهدار با کمک PCR بررسی شد.بر اساس نتایج بهدست آمده،کمترین غلظت DNA در روش CTAB تغییریافته مشاهده شد. غلظت و کیفیت DNA نمونههای برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل در روش SDS تغییریافته بهتر از روش CTAB بود. مقایسه سه روشTrizol تغییریافته، CTAB-LiCl و RNX-Plus در استخراج RNA، نشان داد که روش Trizol تغییریافته از لحاظ وضوح نوارها و غلظت RNA استخراج شده بهتر از دیگر روشها بود. با استفاده از این پروتکل، نسبت جذب A260/280 نانومتر از 01/2 تا 10/2 متغیر بود که نشان دهنده کیفیت بالای RNA جدا شده بدون آلودگی فنولی یا پروتئینی است. علاوه بر این، نسبت A260/A230 نانومتر بین 99/1 و 15/2 بود که نشان میدهد RNA استخراج شده بدون پلی ساکارید است. ساخت cDNA ازRNAاستخراج شدهاز سه بافت سیکلامن ایرانی تنها در دو روشTrizol و RNX-Plusبا موفقیتانجام شد. برای بررسی کیفیت نمونههای RNA، امکان بیان ژنهای خانهدار با استفاده از RT-PCR ارزیابی شد. نتایج RT-PCR نشان داد که در بین ژنهای خانهدار، TUB و 18Sدر همه نمونههای برگ، گلبرگ و هیپوکوتیل سیکلامن ایرانی از وضوح باند بیشتر و کیفیت بالاتری برخورداربودند.
